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TCT液基细胞专用玻片分享免疫组化SABC法操作流程

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TCT液基细胞专用玻片分享免疫组化SABC法操作流程

发布日期:2014-08-07 00:00 来源:http://www.hmclyq.com 点击:

    TCT液基细胞专用玻片分享免疫组化SABC法操作流程

    1、洗载玻片

    将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37 oC温箱中,将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys带正电,而大多数的组织带负电荷,从而产生吸附作用。

    2、包埋组织

    先在铁模具中加入一些液态石蜡,先稍微冷却,然后再将待包埋的组织置于石蜡之中,并排列整齐,再将塑料模具盒盖上,最后加入少许液体石蜡,进行冷冻,使石蜡变成固态。

    3、切片

    将包埋好的组织从模具上取下来,并置于石蜡切片机上,切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致,然后调节切片的厚度,一般为5 um,如果比较难切,则可以适当调整厚度,用毛笔将切割的载玻片向外拉,并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 oC温水中。

    4、捞组织

    当组织载玻片置于40 oC温水中之前,要先将水浴中的气泡赶走,以免气泡受热上浮而贴到组织上,组织受热展开,最好是组织不起皱纹,用载玻片捞组织时,一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张,其中2-3张是备用的,每张载玻片上通常捞两份组织,做对照使用,这样形成的误差就比较小了,而且捞载玻片的时候最好方向一致,以便观察,再将捞出来的载玻片置于架子上,放入37 oC温箱中烘干。

    5、脱蜡

    依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10 min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15 min。

    6、抗原修复

    脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2浸泡10 min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3 min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

    7、血清封闭

    冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5 min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37 oC温箱中半小时。血清稀释10倍(900 ul PBS:100 ul血清封闭液)。

    8、加一抗

    将温箱中的载玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,加一抗,如果做对照实验,就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4oC冰箱中保存过夜。

    9、加二抗

    将载玻片从冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37oC温箱中半小时。

    10、加SABC

    将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37oC 温箱中半小时。SABC稀释100倍(990ul PBS:10ul SABC)。

    11、加显色剂

    将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀)   A:DAB   B:H2O2   C:磷酸缓冲液

    12、复染

    将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。

    13、脱水

    将复染后的片子置于水中冲洗后,依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。

    14、封片

    用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。



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